2’-MOE Phosphorothioate 올리고뉴클레오타이드의
혈장 내 추출 및 LC-MS/MS 분석 실전 가이드
올리고뉴클레오타이드(Oligonucleotides)는 유전자 발현을 조절할 수 있는 차세대 치료제로 주목받고 있지만, 혈장과 같은 복잡한 생체 시료 내에서 낮은 농도로 존재하며 독특한 물리화학적 성질로 인해 정밀한 분석이 매우 까다롭습니다. 본 가이드에서는 Clarity® OTX™ SPE와 Biozen™ Oligo 컬럼을 활용하여 원숭이 혈장 내 2’-MOE Phosphorothioate를 효과적으로 추출하고 정량하는 최적의 워크플로우를 제시합니다.
30-second Summary: 분석 핵심 성과
- 우수한 선형성: 5 ~ 2500 ng/mL 농도 범위에서 0.99 이상의 결정계수(R²)를 확보하여 광범위한 정량이 가능합니다.
- 높은 정밀도와 정확도: 모든 QC 샘플에서 ± 15% 이내의 정확도와 6.0% 미만의 변동계수(%CV)를 기록하며 데이터 신뢰성을 검증했습니다.
- 효율적인 전처리: Clarity OTX를 이용한 단일 단계 SPE 공정으로 복잡한 혈장 단백질 및 간섭 물질을 효과적으로 제거했습니다.
Official Data vs. Columnpia Insight
제조사 공식 데이터와 컬럼피아 전문가의 실무 통찰을 비교하여 분석합니다.
| 구분 | 제조사 공식 데이터 (Phenomenex) | Columnpia 실무 Insight 💡 |
|---|---|---|
| 핵심 기술 | Clarity OTX 1-step SPE 추출 | Lysis Loading Buffer가 단백질 결합을 끊어 회수율을 극대화하는 핵심입니다. |
| 검출 한계 | 5 ng/mL LLOQ 달성 | 더 낮은 농도가 필요할 경우 Microelution 포맷을 사용하여 농축 효율을 높일 수 있습니다. |
| 컬럼 성능 | Biozen 2.6 µm Oligo (유기 용매 내성 우수) | 80°C 고온 분석 시에도 고정상이 안정적이며, 올리고의 2차 구조를 펴주어 피크 모양을 개선합니다. |
| 이온쌍 제제 | HFIP / DIPEA 조합 사용 | HFIP 농도를 0.1~0.2%로 낮추면 감도를 추가로 향상시킬 수 있는 여지가 있습니다. |
이온쌍 제제 (Ion-pairing Agents)Visual Aid 🥾
"올리고의 미끄러운 발에 신겨주는 '아이젠'": 올리고뉴클레오타이드는 물과 친한 성질(친수성)이 강해 역상 컬럼에서 그냥 흘러내려 가기 쉽습니다. HFIP나 DIPEA 같은 이온쌍 제제는 올리고와 결합하여 적당히 기름진 성질을 부여함으로써 컬럼에 잘 머물게 돕습니다.
EDTA (Chelating Agent)Visual Aid 🛡️
"금속 이온 자석으로부터 올리고를 지키는 '보호막'": 올리고는 금속 이온에 달라붙는 성질이 강해 기기 내부 금속 성분에 흡착될 수 있습니다. 이동상에 소량 첨가된 EDTA는 이런 금속 이온을 미리 낚아채어 올리고가 손실 없이 검출기까지 도달하게 만듭니다.
Experimental Conditions & Results
| Column | Biozen™ 2.6 µm Oligo 100 × 2.1 mm |
| Mobile Phase | 1.0% HFIP, 0.1% DIPEA in Water (A) / ACN (B) |
| Temperature | 80°C |
| MS System | SCIEX Triple Quad™ 6500+ |
01. 정량 결과 요약 (Standard Curve)
| Nominal Conc. (ng/mL) | Mean Measured (ng/mL) | Accuracy (%) | %CV |
|---|---|---|---|
| 5 (LLOQ) | 5.33 | 106.6 | 5.8 |
| 200 | 201 | 100.4 | 3.8 |
| 2500 (ULOQ) | 2431 | 97.2 | 0.8 |
02. MS Scan & Extracted Ion Chromatogram
[AI 상세 캡션]: (상단) 2’-MOE SSO의 Q1 스캔 결과, -7가 전하 상태(m/z 1017.0)에서 최적의 응답을 확인하였습니다. (하단) Biozen Oligo 컬럼을 통해 분리된 5ng/mL (Std-1)와 2500ng/mL (Std-8) 표준물질의 크로마토그램으로, 노이즈가 억제된 선명한 피크를 보여줍니다.
03. Calibration Curve
[AI 상세 캡션]: 원숭이 혈장에서 추출된 SSO의 검량선으로, 5 ~ 2500 ng/mL 범위에서 뛰어난 직선성을 나타내며 약동학(PK) 연구에 적합한 성능을 입증합니다.
데이터 해석 및 실무 제언
본 실험 데이터는 Clarity OTX 전처리가 혈장 내 복잡한 단백질 간섭을 제거하면서도 올리고뉴클레오타이드를 높은 수율로 회수함을 보여줍니다. 특히 Biozen Oligo 컬럼의 높은 내열성(80°C)은 분석 시간 단축과 피크 대칭성 확보에 결정적인 역할을 합니다.
전문가 제언 3단계: 성공적인 올리고 분석을 위한 체크리스트
01시료 준비 시 혼합 철저
Lysis Buffer 첨가 후 충분한 Vortex mixing(~5분)과 상온 방치를 통해 단백질과 결합된 올리고를 완전히 해리시키십시오.
02시스템 흡착 방지
이동상과 샘플 용기에 EDTA를 사용하여 금속 흡착에 의한 감도 저하를 방지하십시오.
03컬럼 세척 루틴
분석 중간에 유기용매 함량을 높인 Column Wash 단계를 추가하여 Carryover(잔류 효과)를 최소화하십시오.
참고 자료 및 원문
Extraction of 2’-MOE Phosphorothioate from Plasma Using Clarity OTX Solid Phase Extraction (SPE)
원문 보기