Tirzepatide 불순물 프로파일링 & 안정성 시험법
Kinetex PS C18으로 9종 불순물 + 강제분해 생성물 완전 분리
TN-1397 · Phenomenex Technical Note
30초 요약
3-in-1 메소드
Assay(정량) + Related Substances(불순물) + Stability-Indicating(안정성) 3개 메소드를 Kinetex PS C18 단일 고정상으로 개발
9 + 2 불순물 완전 분리
9종 known impurity와 2종 unknown impurity를 모두 Tirzepatide로부터 분리, USP Resolution ≥ 1.0
강제분해 4종 검증
산/염기/산화/열 분해 조건에서 최대 18개 분해 피크를 주성분으로부터 분리, PDA peak purity 확인
공식 데이터 vs 컬럼피아 실무 인사이트
제조사 공식 Spec
- Kinetex 2.6 µm PS C18, 150 × 4.6 mm(Assay/RS) 및 250 × 4.6 mm(Stability)
- Mobile Phase: 0.1% TFA in Water / 0.1% TFA in Acetonitrile
- 온도 60 °C, 검출 215 nm
- 6회 반복 주입 %RSD: RT 0.0~0.2%, Area 0.6~4.9%
컬럼피아 실무 인사이트
- PS C18의 양전하 표면 개질 → acidic analyte 보유력 향상, basic compound 피크 테일링 개선
- Core-Shell 입자 → 좁은 피크폭으로 구조적 유사 불순물 간 분리도 향상
- Assay 45분 / RS 72분 / Stability 112분:목적별 gradient 최적화 전략
- Tirzepatide 최초 불순물 메소드 보고서 → 분석법 개발 레퍼런스로 활용
🛋️ The Interpreter: 기술 용어 쉽게 풀기
🧲 PS C18 (Positive Surface)이란?
일반 C18 컬럼의 실리카 표면은 약산성이라 염기성 화합물이 "달라붙어" 피크가 뒤로 끌립니다(테일링). PS C18은 표면을 양전하로 개질하여 마치 "미끄러운 코팅"을 입힌 것처럼 염기성 물질이 깔끔하게 용출됩니다. 동시에 산성 analyte는 오히려 더 잘 잡혀 보유력이 올라갑니다.
🍑 강제분해 시험(Forced Degradation) 왜 필요한가?
약물이 산·염기·빛·열에 노출되면 어떻게 변하는지 일부러 극한 조건을 만들어 테스트합니다. 마치 자동차 충돌 테스트처럼 — 실제 사고 전에 안전성을 확인하는 것입니다. 분해 생성물이 주성분과 분리되어야 "이 분석법이 안정성을 감시할 수 있다"고 인정받습니다.
실험 조건 및 데이터
LC 분석 조건 비교 (3개 메소드)
| 파라미터 | Assay | Related Substances | Stability-Indicating |
|---|---|---|---|
| Column | Kinetex 2.6 µm PS C18 150 × 4.6 mm (00F-4780-E0) | Kinetex 2.6 µm PS C18 150 × 4.6 mm (00F-4780-E0) | Kinetex 2.6 µm PS C18 250 × 4.6 mm (00G-4780-E0) |
| Mobile Phase A | 0.1% Trifluoroacetic Acid in Water | ||
| Mobile Phase B | 0.1% Trifluoroacetic Acid in Acetonitrile | ||
| Flow Rate | 1.2 mL/min | 1.0 mL/min | 1.0 mL/min |
| Temperature | 60 °C | ||
| Detection | UV @ 215 nm | ||
| Injection | 10 µL | ||
| Run Time | 45 min | 72 min | 112 min |
| LC System | Waters Arc HPLC | ||
Related Substances 분석 결과 (1% Spike)
| No. | Analyte | RT (min) | % Area | USP Res. | USP Tailing |
|---|---|---|---|---|---|
| 1 | Des Side chain-Tirzepatide | 9.044 | 1.19 | — | 0.9 |
| 2 | Unknown Impurity 1 | 13.164 | 0.11 | 24.1 | 0.8 |
| 3 | Des Tyr(10)-Tirzepatide | 31.952 | 0.97 | 48.1 | 0.9 |
| 4 | Des-Tyr(1)-Aib(2)-Tirzepatide | 32.641 | 0.74 | 1.2 | 1.1 |
| 5 | Endo-AEEAc-Tirzepatide | 34.633 | 0.50 | 3.6 | 0.9 |
| 6 | Endo-Gly(4)-Tirzepatide | 35.224 | 0.44 | 1.2 | 0.9 |
| 7 | Endo-Thr(5)-Tirzepatide | 35.752 | 0.44 | 1.1 | 1.1 |
| 8 | Tirzepatide (API) | 36.619 | 91.43 | 1.0 | 2.6 |
| 9 | Unknown Impurity 2 | 38.706 | 0.92 | 2.1 | 0.9 |
| 10 | Endo-Tyr(1)-Tirzepatide | 39.588 | 0.86 | 1.2 | 1.1 |
| 11 | Des-AEEAc-Tirzepatide | 41.035 | 1.29 | 1.8 | 0.9 |
| 12 | Des-γ-Glu-Tirzepatide | 51.274 | 1.11 | 11.3 | 0.9 |
강제분해 시험 결과
| 조건 | 스트레스 조건 | % Degradation | 분해 피크 수 |
|---|---|---|---|
| Control | — | 1.22 | 2 |
| Acid | 0.1 mL of 1 N HCl, RT, 4 Days | 17.94 | 17 |
| Base | 0.1 mL of 0.1 N NaOH, RT, 1 Hour | 9.35 | 3 |
| Oxidative | 0.1 mL of 10% H₂O₂, RT, 4 Days | 23.53 | 18 |
| Thermal | 80 °C water bath, 18 Hours | 20.71 | 18 |
Figure 1. Standard Solution (0.4 mg/mL) for Assay on Kinetex 2.6 µm PS C18, 150 x 4.6 mm.
Tirzepatide 표준 용액의 Assay 크로마토그램. 2종의 미확인 불순물이 저농도로 검출되었으며, Tirzepatide 주피크로부터 완전히 분리됩니다. Kinetex PS C18의 core-shell 입자 구조가 좁은 피크폭을 제공합니다.
Figure 3. Chromatogram of Tirzepatide standard spiked with known impurities at 1% level on Kinetex 2.6 µm PS C18, 150 x 4.6 mm.
9종 known impurity 1% spike 시 전체 분리 크로마토그램. 모든 피크가 USP Tailing 0.8~1.8 범위 내이며, Tirzepatide 주피크 전후로 불순물이 분포합니다.
Figure 4. Overlayed chromatogram of blank and Tirzepatide standard spiked with known impurities at 1.0% level on Kinetex 2.6 µm PS C18, 150 x 4.6 mm.
Related Substances 분석: 72분 gradient로 12개 피크 모두 resolution ≥ 1.2로 분리. 0.3%~1.5% spike 농도에서도 분리도가 일관되게 유지되었습니다.
Figure 11. Overlayed chromatogram of samples exposed to varied types of forced degradation approaches on Kinetex 2.6 µm PS C18, 250 x 4.6 mm.
산/염기/산화/열 분해 + 대조군 + spiked 시료 오버레이. 산화 분해(23.53%)와 열 분해(20.71%)에서 가장 많은 분해 피크(각 18개)가 발생하며, 모든 분해 생성물이 Tirzepatide 주피크로부터 분리되어 stability-indicating 능력이 검증되었습니다.
데이터 해석 및 실무 제언
PS C18의 다중 상호작용 선택성
Tirzepatide는 39개 아미노산 + C20 지방산 모이어티를 가진 복잡한 구조입니다. Kinetex PS C18의 양전하 표면 개질은 소수성 상호작용 외에도 정전기적 상호작용을 추가하여, 구조적으로 매우 유사한 절단 서열(truncated), 삽입 불순물(endo-), 결실 불순물(des-)을 효과적으로 분리합니다.
gradient 최적화 전략
Assay(45분): 빠른 정량 → RS(72분): 정밀 분리 → Stability(112분): 극한 조건 분해 생성물 포함.동일 Mobile Phase(0.1% TFA)를 유지하면서 gradient 기울기와 컬럼 길이만 조정하여 3가지 목적을 달성한 것이 이 메소드의 핵심 효율성입니다.
강제분해 해석 포인트
산화 분해(H₂O₂, 23.53%)와 열 분해(80°C, 20.71%)에서가장 높은 분해율을 보였습니다. 이는 Tirzepatide의 Met, Trp 등 산화에 민감한 잔기와 C20 지방산 링커의 열 불안정성을 반영합니다. 제조·보관 환경에서 온도와 산화 방지가 품질 관리의 핵심임을 시사합니다.
전문가 제언
01. 컬럼 길이는 분석 목적에 맞게 선택하세요
빠른 정량(Assay)에는 150 mm, 정밀 불순물 프로파일링에는 250 mm를 사용합니다. 동일 고정상 + 동일 Mobile Phase에서 컬럼 길이만 변경하면 메소드 전환이 간편합니다.
02. 60°C 컬럼 온도는 펩타이드 분리에 효과적입니다
높은 온도는 펩타이드의 2차 구조 풀림을 촉진하여컬럼 내 형태(conformer) 관련 피드 브로드닝을 억제합니다. 특히 39-mer인 Tirzepatide에서 60°C가 최적 피크 형태를 제공한 점을 참고하세요.
03. Spike 농도별 분리도 확인은 필수입니다
0.3%, 0.6%, 1.0%, 1.5% 4단계 spike에서 모든 resolution이 일관되었습니다. 이는 메소드의 Robustness를 입증하며, 실제 배치 간 불순물 농도 변동에도 신뢰할 수 있는 분석 결과를 보장합니다.
참고 자료 및 원문
TN-1397: Optimized HPLC method development of Tirzepatide using Kinetex PS C18: Assay, Impurity Profiling, and Stability Indicating for Degradation Products
D N Arunkumar, Rajesh Babu Dandamudi, PhD, Sean Orlowicz — Phenomenex, Inc.
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연관 기술자료
이 솔루션과 관련된 애플리케이션 노트 및 기술 문서