Tirzepatide Preparation and Purification
Luna C18(3) Prep + Luna C18(2) Analytical 정제 워크플로우
AN-1179 · Phenomenex Application Note
30초 요약
Crude 77.79% → 97.43%
Luna 10 µm-PREP C18(3) 컬럼으로 Crude Tirzepatide (77.79%)를 97.43% 순도까지 정제
120 mg 스케일 정제
120 mg Crude를 DMSO에 용해 → 10 mL 주입으로 Prep 스케일 정제 수행
Fraction 순도 확인
36.0–48.1분 분획을 Luna 5 µm C18(2) Analytical 컬럼으로 순도 검증
공식 데이터 vs 컬럼피아 실무 인사이트
제조사 공식 Spec
- Prep: Luna 10 µm-PREP C18(3), 250 × 10 mm (00G-4616-N0)
- Analytical: Luna 5 µm C18(2), 250 × 4.6 mm (00G-4252-E0)
- Prep 이동상: 10 mM Ammonium Acetate / ACN:Buffer (80:20)
- Analytical 이동상: 0.1% TFA in Water / 0.1% TFA in ACN
컬럼피아 실무 인사이트
- Prep C18(3)과 Analytical C18(2)는 다른 고정상 → 이동상 조건도 별도 최적화
- Prep: Ammonium Acetate(pH 중성), Analytical: TFA(pH 산성) → 목적별 최적 이동상 설계
- Crude 13종 불순물 중 3종 잔존(1.83%, 0.41%, 0.33%) → 순도 97.43% 달성
- 120 mg DMSO 용해 → Water/ACN(1:1)로 희석 → 10 mL 대용량 주입
🛋️ The Interpreter: 기술 용어 쉽게 풀기
🔄 Prep → Fraction Collection → Analytical
먼저 큰 Prep 컬럼(250 × 10 mm)에 Crude를 대량 주입하여 주성분을 분리합니다. 원하는 시간 구간 (36.0–48.1분)의 분획(Fraction)을 수집한 뒤, Analytical 컬럼(250 × 4.6 mm)으로 순도를 검증합니다.
🧪 C18(3) vs C18(2)의 차이
Luna C18(3)은 TMS endcapping이 적용된 Fully Porous 입자로 높은 로딩 용량에 최적화되어 Prep에 적합합니다. Luna C18(2)은 다른 endcapping 화학으로분석 재현성에 최적화되어 순도 확인(Analytical)에 사용됩니다.
실험 조건 및 데이터
LC 분석 조건 비교 (Purification vs Analytical)
| 파라미터 | Purification | Analytical Purity Testing |
|---|---|---|
| Column | Luna 10 µm-PREP C18(3) 250 × 10 mm (00G-4616-N0) | Luna 5 µm C18(2) 250 × 4.6 mm (00G-4252-E0) |
| Mobile Phase A | 10 mM Ammonium Acetate in Water | 0.1% Trifluoroacetic Acid in Water |
| Mobile Phase B | ACN / 10 mM Ammonium Acetate in Water (80:20, v/v) | 0.1% Trifluoroacetic Acid in ACN |
| Gradient | 0 min → 40%B, 50 min → 47%B | 0 min → 40%B, 30 min → 55%B |
| Flow Rate | 5.0 mL/min | 1.0 mL/min |
| Injection Volume | 10 mL | 30 µL |
| Temperature | Ambient | 30 °C |
| Detection | UV @ 220 nm | |
| LC System | Octopus Plus (Agela) | Agilent® 1100 Series |
정제 후 분획 분석 결과 (36.0–48.1 min Fraction)
| Peak No. | Analyte | RT (min) | Area | Tailing | Res. (USP) | % Area |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 1 | Tirzepatide Impurity | 19.74 | 249,828 | — | — | 1.83 |
| 2 | Tirzepatide | 20.74 | 13,296,084 | 1.223 | 1.06 | 97.43 |
| 3 | Tirzepatide Impurity | 21.76 | 56,531 | — | 0.82 | 0.41 |
| 4 | Tirzepatide Impurity | 22.19 | 44,235 | — | 0.34 | 0.33 |
Crude Tirzepatide 분석 결과 (정제 전)
| Peak No. | Analyte | RT (min) | Area | Tailing | Res. (USP) | % Area |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 1 | Tirzepatide Impurity | 3.38 | 174,399 | 1.048 | — | 0.99 |
| 2 | Tirzepatide Impurity | 17.66 | 939,924 | 0.854 | 23.18 | 5.36 |
| 3 | Tirzepatide Impurity | 19.56 | 624,074 | — | 1.70 | 3.56 |
| 4 | Tirzepatide Impurity | 19.94 | 676,844 | — | 0.30 | 3.86 |
| 5 | Tirzepatide | 20.74 | 13,652,063 | 1.299 | 0.92 | 77.79 |
| 6 | Tirzepatide Impurity | 22.16 | 342,276 | — | 2.56 | 1.95 |
| 7 | Tirzepatide Impurity | 22.62 | 93,869 | — | 0.70 | 0.54 |
| 8 | Tirzepatide Impurity | 23.35 | 227,951 | — | 1.01 | 1.30 |
| 9 | Tirzepatide Impurity | 24.31 | 251,029 | — | 1.28 | 1.43 |
| 10 | Tirzepatide Impurity | 27.07 | 204,392 | 1.033 | 3.69 | 1.16 |
| 11 | Tirzepatide Impurity | 27.80 | 31,126 | 1.106 | 1.38 | 0.18 |
| 12 | Tirzepatide Impurity | 28.54 | 141,083 | — | 1.18 | 0.80 |
| 13 | Tirzepatide Impurity | 28.96 | 190,274 | — | 0.55 | 1.08 |
Figure 1. Preparative Chromatogram.
Luna 10 µm-PREP C18(3) 컬럼(250 × 10 mm)으로 Crude Tirzepatide를 분리한 Prep 크로마토그램입니다. 10 mM Ammonium Acetate 이동상에서 40–47% B gradient(50분)로 분리되었으며, 36.0–48.1분 구간의 Tirzepatide 분획을 수집하였습니다.
Figure 3. Detection Pattern of Crude Tirzepatide Using the Luna 5 µm C18(2) HPLC Column.
Crude Tirzepatide의 분석 크로마토그램입니다. 주피크(Peak 5, RT 20.74분) 순도는 77.79%이며, 주피크 전후에 12종의 불순물 피크가 확인됩니다. 가장 큰 불순물은 Peak 2(RT 17.66분, 5.36%)입니다.
데이터 해석 및 실무 제언
정제 효과: 불순물 12종 → 3종
Crude에서 확인된 12종의 불순물 중 Prep 정제 후 3종만 잔존하며, 합계 면적은 2.57%(1.83% + 0.41% + 0.33%)입니다. Crude 77.79%에서 97.43%로 약 20%p의 순도 향상을 달성했습니다.
Prep과 Analytical의 이동상 전략
Prep에서는 Ammonium Acetate(pH 중성)를 사용하여 대용량 로딩 시 피크 형태를 유지하고, Analytical에서는 TFA(pH 산성)를 사용하여 최대 분리능으로 순도를 검증합니다. 두 단계의 이동상 전략을 분리함으로써 각 목적에 최적화된 분리 성능을 발휘합니다.
전문가 제언
01. DMSO 용해 → Water/ACN 희석 전략
120 mg의 Crude Tirzepatide를 먼저 5 mL DMSO에 완전 용해한 후, 5 mL Water/ACN(1:1)으로 희석하여 10 mL을 주입합니다. DMSO는 소수성 펩타이드의 용해력이 높으며, Water/ACN 희석으로 초기 이동상 조건에 근접한 용매 강도를 만들어 피크 브로드닝을 최소화합니다.
02. 분취 구간(36.0–48.1분) 최적화
정제 효율을 높이려면 분취 시작/종료 시점을 정밀하게 설정해야 합니다. Peak의 앞쪽 숄더와 뒤쪽 테일에 불순물이 혼입될 수 있으므로, 주피크의 중심 부분만 수집하는 것이 권장됩니다. 이 경우 회수율은 감소하지만 순도는 향상됩니다.
03. 잔존 불순물 1.83%에 대한 고려
정제 후 가장 큰 불순물(Peak 1, RT 19.74분, 1.83%)은 Tirzepatide 주피크(20.74분) 바로 앞에 용출됩니다. 분취 윈도우를 조금 더 늦게 시작하면 이 불순물을 추가로 제거할 수 있으나, Tirzepatide 회수율이 감소합니다. 목적에 따라 순도 vs 회수율 균형을 조절하세요.
참고 자료 및 원문
AN-1179: Tirzepatide Preparation and Purification
Wei Liu, Liuliu Wu (Tianjin Bona Agela Co., Ltd) and Bryan Tackett, PhD (Phenomenex, Inc.)
연관 기술자료
이 솔루션과 관련된 애플리케이션 노트 및 기술 문서