Trastuzumab(트라스투주맙) 전하 변이체 분석 가이드:
bioZen™ WCX와 Native MS를 활용한 정밀 분해능 확보
항체 의약품의 전하 변이(Charge Variant) 분석은 생산 공정 중 발생하는 번역 후 변형(PTM)을 모니터링하기 위한 필수 단계입니다. bioZen 6 µm WCX 컬럼과 휘발성 pH 구배 버퍼를 활용하여, 분석 효율을 극대화하면서 Native MS 데이터까지 한 번에 확보하는 실전 솔루션을 소개합니다.
30-second Summary
- Native MS 직접 연동 가능: 휘발성 버퍼(Ammonium Acetate)를 이용한 pH 구배 시스템을 구축하여, 복잡한 전처리 없이 Native MS로 변이체를 즉시 식별합니다.
- 동등한 분리 성능: 기존의 비휘발성 버퍼(HEPES) 및 Salt 구배 방식과 비교했을 때 매우 유사하고 뛰어난 크로마토그램 결과(Selectivity)를 제공합니다.
- 고해상도 당쇄화(Glycoform) 식별: 250 mm 장컬럼 사용 시, Main Peak와 Lysine Variant 내의 미세한 당쇄 구조 차이(Δm<30 ppm)까지 정밀하게 구분합니다.
Official Data vs. Columnpia Insight
제조사 공식 데이터와 컬럼피아 전문가의 실무 통찰을 비교하여 분석합니다.
| 구분 | 제조사 공식 데이터 (Phenomenex) | Columnpia 실무 인사이트 (Expert Interpretation) |
|---|---|---|
| 핵심 기술 | pH 구배(pH 5.2 to 10.2) 기반 분리 | Salt 구배 대비 피크 순서(Elution Order) 예측이 용이하며, 특히 산성/염기성 변이체 거동 확인에 유리합니다. |
| 버퍼 안정성 | SecurityCAP™ 사용 시 실온에서 최소 1주일 안정 | 휘발성 버퍼 특성상 pH 변화가 빠를 수 있으므로, 재현성을 위해 밀폐형 캡과 공기 필터 사용은 선택이 아닌 필수입니다. |
| 분석 환경 | Native Conditions (MS-friendly) | 분석 과정에서 의도치 않은 PTM(추가적인 변형) 발생을 억제하여, 실제 항체의 상태를 가장 정확하게 반영합니다. |
약이온교환 (WCX)
"전기적 낚시터 🎣": 항체 표면의 전하 상태에 따라 컬럼(Stationary Phase)에 달라붙는 힘이 달라집니다. 전하가 약한 변이체는 빨리 통과하고, 강한 변이체는 나중에 낚여 올라오는 원리입니다.
pH Gradient
"수문 조절 🌊": 이동상의 pH를 서서히 높여 항체와 컬럼 사이의 전기적 인력을 약화시키는 과정입니다. 특정 pH 지점에서 항체가 컬럼과의 결합을 풀고 수문이 열리듯 순차적으로 용리(Elution)됩니다.
Experimental Conditions & Results
bioZen 6 µm WCX는 입자 크기와 공극의 균일성이 뛰어나 pH 변화에 민감한 변이체 분석에서 탁월한 재현성을 보여줍니다.
1. 분석 기기 및 분석 조건 요약
| 항목 | UV 분석 조건 (고속 스크리닝) | LC-MS/MS 조건 (상세 동정) |
|---|---|---|
| Column | bioZen 6 µm WCX | bioZen 6 µm WCX |
| Dimension | 50 × 2.1 mm | 250 × 2.1 mm |
| Mobile Phase A | 20 mM Ammonium Acetate, pH 5.2 | 20 mM Ammonium Acetate, pH 5.2 |
| Mobile Phase B | 5 mM Ammonium Acetate, pH 10.2 | 5 mM Ammonium Acetate, pH 10.2 |
| Gradient | 20-50% B in 5 min | 20-50% B in 25 min |
| Flow Rate | 0.5 mL/min | 200 µL/min |
Figure 1. pH 구배를 이용한 Trastuzumab UV 크로마토그램
짧은 분석 시간(5분) 내에 주요 피크와 산성/염기성 변이체가 명확히 분리됨을 보여줍니다.
Figure 2. Native MS TIC Chromatogram & Glycoform ID
250 mm 장컬럼을 사용하여 각각의 변이체 피크를 Native MS로 직접 분석하여 G0F, G1F 등 다양한 당쇄화 형태(Glycoforms)를 식별한 결과입니다.
데이터 해석 및 실무 제언
본 어플리케이션의 핵심은 "휘발성 버퍼만으로도 기존 Salt gradient 이상의 분리능을 얻을 수 있다"는 점입니다. Trastuzumab의 메인 피크뿐만 아니라, C-terminal Lysine 변이체 및 다양한 당쇄화(G0, G0F, G1F, G2F) 조합을 Native MS 상에서 매우 낮은 오차 범위(Δm 기준 -5 to -27 ppm) 내에서 성공적으로 확인하였습니다. 이는 QC 단계에서 미지의 피크가 발견되었을 때, 추가적인 분취나 탈염 과정 없이 즉시 구조를 규명할 수 있음을 의미합니다.
전문가 제언 3단계: 성공적인 분석을 위한 체크리스트
01버퍼 휘발 방지
Ammonium Acetate 버퍼는 시간에 따라 pH가 변할 수 있으므로, 반드시 SecurityCAP™과 같은 밀폐 시스템을 사용하여 재현성을 확보하십시오.
02목적에 맞는 컬럼 길이 선택
빠른 모니터링이 목적이라면 50 mm 컬럼을, 상세한 PTM 동정이 목적이라면 분해능이 극대화된 250 mm 컬럼을 권장합니다.
03유량 최적화
MS 연동 시에는 이온화 효율을 높이기 위해 200 µL/min 수준의 낮은 유량에서 최적의 감도를 얻을 수 있습니다.
참고 자료 및 원문
Charge Variant Analysis of Trastuzumab using a bioZen™ 6 µm WCX Column with a pH Gradient and Native MS Detection
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