Biozen HPLC/UHPLC 컬럼 관리 및 세척 가이드

컬럼 성능 유지 및 수명 연장을 위한 전문 가이드

컬럼 세척

컬럼 보관

컬럼 관리

Biozen 컬럼 제품군

Biozen 컬럼 제품군 개요
분석 모드별 Biozen 컬럼 분류
역상(RP) 컬럼 제품군
SEC/GFC 컬럼 제품군
기타 모드 컬럼 제품군

컬럼 설치 및 시스템 점검

컬럼 검사 및 초기 점검
시스템 준비 및 점검
이동상 및 용매 준비
컬럼 설치 절차
컬럼 컨디셔닝 및 평형화
권장 및 최대 유속

컬럼 성능 관리

컬럼 성능 테스트

컬럼 세척

역상 컬럼 세척 - 일반 절차
역상 컬럼 세척 - 대체 절차
HILIC 및 Oligo 컬럼 세척
SEC/GFC 컬럼 세척
약한 양이온 교환(WCX) 컬럼 세척

컬럼 보관

컬럼 보관 원칙
역상 컬럼 보관 조건
SEC/GFC 및 이온 교환 컬럼 보관 조건

컬럼 수명 연장 및 문제 해결

컬럼 수명 연장을 위한 주의사항
문제 해결 가이드
요약 및 결론

Biozen 컬럼 제품군 개요

Biozen는 다양한 분석 요구사항에 적합한 다양한 컬럼 제품군을 제공합니다. 각 컬럼은 특정 분석 모드에 최적화되어 있으며, 아래 표는 주요 컬럼 제품과 그들의 특성을 요약합니다.

역상(RP) 컬럼

Biozen 1.7/2.6 μm Oligo: C18 역상계열, 올리고뉴클레오타이드의 미세한 차이(예: n/n-1)에 대한 높은 선택성
Biozen Peptide PS-C18: 양이온 표면 리간드와 C18 리간드의 결합으로 인한 펩타이드의 뛰어난 머무름(retention)
Biozen Peptide XB-C18: di-isobutyl 측쇄(side chain)가 적용된 C18 리간드를 사용하여 펩타이드 분석 시 개선된 머무름과 선택성 제공

HILIC 컬럼

Biozen 2.6 μm Glycan: 방출된 glycans를 위한 최적화된 표면 선택성 제공
HPLC 및 UHPLC에 적합한 pH 범위: 2-7.5
아세토니트릴/0.1 M 암모늄 포메이트(Ammonium Formate), pH 3.2 (90:10)

SEC/GFC 컬럼

Biozen 1.8 μm SEC-2: 1–450 kDa 분리 범위. 낮은 분자량(LMW) 영역(예: 펩타이드, 항체 단편) 분리에 적합.
Biozen 1.8 μm SEC-3: 10–700 kDa 분리 범위. 높은 분자량(HMW) 영역(예: 항체, 응집체) 분리에 적합.
0.1 M 포스페이트(Phosphate) 버퍼, pH 6.8

WCX 컬럼

Biozen 6 μm WCX: 비다공성(Non-Porous) 고분자(Polymeric) 입자를 사용하여, 단백질 **전하 변이체(Charge Variants)**를 고효율/고해상도로 분리
생물 분자의 고유 형태(Native Form)를 보존하는 이온 교환(Ion-Exchange) 조건에서 분리
20 mM 소듐 포스페이트(Sodium Phosphate) + 150 mM NaCl (염 농도 구배로 용리)

Native RP 컬럼

Biozen Native RP: Intact DAR(항체-약물 접합 비율) 및 그 이성체 특성 분석, **단백질의 본래 형태(Native form)**를 유지하며 분리
HPLC 및 UHPLC에 적합. (배송/보관 용매 예시: ACN/Water 65:35)
작동 pH 범위: 1.5–8.5 (온도 안정성은 조건에 따라 다름)

핵심 특징

모든 Biozen 컬럼은 개별 제조 및 테스트됨
품질 보증서(COA) 포함
HPLC 및 UHPLC 시스템의 높은 압력 및 넓은 온도 범위에서 안정적으로 작동하도록 설계됨

분석 모드별 Biozen 컬럼 분류

역상 (RP)

C18 stationary phase를 사용하는 일반적인 역상 크로마토그래피 모드로, 소수성 상호작용을 기반으로 분리합니다.

Biozen 1.7/2.6 μm OligoBiozen 1.6/3 μm Peptide PS-C18Biozen 1.7/2.6 μm Peptide XB-C18Biozen 1.6/3 μm Peptide Polar-C18Biozen 2.6 μm WidePore C4Biozen 3.6 μm Intact XB-C8

크기 배제 크로마토그래피 (SEC)

분자 크기를 기반으로 분리하는 모드로, 단백질 및 생물학적 분자의 분석에 적합합니다.

Biozen 1.8 μm SEC-2Biozen 1.8 μm SEC-3Biozen 3 μm dSEC-7Biozen 1.8/3 μm dSEC-2Biozen 1.6/3 μm dSEC-1

네이티브 역상 (Native RP)

비다공성 입자, 생물학적 분자의 자연 형태를 보존하도록 설계된 모드로, 항체 및 생물의약적 분석에 적합합니다.

Biozen 3 μm Native RP-1Biozen 3 μm Native RP-5

친수성 상호작용 크로마토그래피 (HILIC)

극성 화합물을 분리하기 위해 개발된 모드로, 아세토니트릴/물 혼합물 이동상을 사용합니다.

Biozen 2.6 μm Glycan

이온 교환 (IEX)

전하 상호작용을 기반으로 분리하는 모드로, 특히 WCX 컬럼은 약한 양이온 교환 분리에 적합합니다.

Biozen 6 μm WCX

컬럼 특성 비교

특성	RP	HILIC	SEC	IEX	Native RP
최대 pH	8.5	7.5	8.5	12.0	8.5
최대 압력	~15000 psi	8700 psi	~8000 psi	6000 psi	15000 psi
권장 온도	~90℃	60℃	50℃	60℃	35℃

역상(RP) 컬럼 제품군

Biozen Oligo

아세토니트릴/물 (60:40 v/v)로 선적

입자 크기: 1.7 μm / 2.6 μm
기공 크기: 100 Å
표면적: 200 m²/g
탄소 함량: 11%
pH 안정성: 1-12
최대 압력: 15000/8700 psi
최대 온도: 80°C

Biozen Peptide PS-C18

아세토니트릴/물 (65:35 v/v)로 선적

입자 크기: 1.6 μm / 3 μm
기공 크기: 100 Å
표면적: 260 m²/g
탄소 함량: 9%
pH 안정성: 1.5-8.5
최대 압력: 15000 (1.6μm) / 5000 psi (3μm)
최대 온도: 90°C

Biozen Peptide XB-C18

아세토니트릴/물 (65:35 v/v)로 선적

입자 크기: 1.7 μm / 2.6 μm
기공 크기: 100 Å
표면적: 200 m²/g
탄소 함량: 10%
pH 안정성: 1.5-9**
최대 압력: 15000 (1.7μm) / 8700 psi (2.6μm)
최대 온도: 90°C

Biozen Peptide Polar-C18

아세토니트릴/물 (60:40 v/v)로 선적

입자 크기: 1.6 μm / 3 μm
기공 크기: 100 Å
표면적: 260 m²/g
탄소 함량: 9%
pH 안정성: 1.5-8.5*
최대 압력: 15000 (1.6μm) / 5000 psi (3μm)
최대 온도: 80°C

Biozen WidePore C4

아세토니트릴/물 (65:35 v/v)로 선적

입자 크기: 2.6 μm
기공 크기: 400 Å
표면적: 25 m²/g
탄소 함량: -
pH 안정성: 1.5-9**
최대 압력: 12500 psi
최대 온도: 90°C

Biozen Intact XB-C8

아세토니트릴/물 (65:35 v/v)로 선적

입자 크기: 3.6 μm
기공 크기: 200 Å
표면적: 20 m²/g
탄소 함량: -
pH 안정성: 1.5-9**
최대 압력: 8700 psi
최대 온도: 90°C

1.5-8.5* 범위는 그라디언트 조건, 1.5-9** 범위는 그라디언트 조건

SEC/GFC 컬럼 제품군

SEC(GFC)는 분자량에 기반한 분리 메서드로, 단백질 및 생물학적 분석에 널리 사용됩니다.

컬럼 모델	입자 크기 (μm)	기공 크기 (Å)	pH 안정성	권장 용매	최대 압력 (psi/bar)	최고 작동 온도 (°C)
Biozen 1.8 μm SEC-2	1.8	150	1.5-8.5	0.1M 포스페이트 버퍼, pH 6.8	7000/482	50
Biozen 1.8 μm SEC-3	1.8	300	1.5-8.5	0.1M 포스페이트 버퍼, pH 6.8	7000/482	50
Biozen 1.6/3 μm dSEC-1	1.6/3	90	2.5-7.5	NaCl/KCl/포스페이트 버퍼	11000/758 (1.6 μm) · 8000/552 (3 μm)	50
Biozen 1.8/3 μm dSEC-2	1.8/3	200	2.5-7.5	NaCl/포스페이트 버퍼	8000/552 (1.8 μm) · 6500/448 (3 μm)	50
Biozen 3 μm dSEC-7	3	700	2.5-7.5	NaCl/포스페이트 버퍼	6500/448	50

특징

✓분자량에 따라 분리하는 크로마토그래피 기법
✓효율성과 선택성에 중점을 둔 컬럼

적용 분야

✓단백질 및 생물학적 분석
✓SEC-2: 1-450 kDa 분리 범위
✓SEC-3: 10-700 kDa 분리 범위

주의사항

✓미생물 성장 방지를 위해 신선한 이동상 사용
✓온도에 민감하므로 온도 조절 필수

기타 모드 컬럼 제품군

HILIC 컬럼 (Glycan)

Biozen 2.6 μm Glycan 컬럼은 방출된 글리칸에 대한 최적화된 효율성과 선택성을 제공하며, HPLC 및 UHPLC에 적합합니다.

분석 모드HILIC

입자 크기2.6 μm

기공 크기100 Å

표면적200 m²/g

pH 안정성2-7.5

출하 용매아세토니트릴/물 / 0.1M Ammonium Formate, pH 3.2 (90:10)

최대 압력8700/600 psi/bar

최대 온도60℃

약한 양이온 교환 (WCX)

Biozen 6 μm WCX 컬럼은 말씀하신 대로 단백질과 같은 생체 분자의 **전하 변이체(charge variants)**를 분리하는 데 특화된 약한 양이온 교환 컬럼입니다.

분석 모드IEX

입자 크기6 μm

pH 안정성2-12

출하 용매20 mM Sodium Phosphate + 150 mM NaCl + 4 mM NaN3, pH 6.5

최대 압력6000/413 psi/bar

최대 온도60℃

네이티브 역상 (Native RP)

Biozen Native RP 컬럼은 역상 조건에서 완전한 생분자 형태를 보존하도록 설계되었으며, 단백질 및 생물의약적 분석에 적합합니다. Native RP-1은 낮은/중간 소수성, Native RP-5는 중간/높은 소수성을 가진 ADC에 적합합니다.

분석 모드Native RP

입자 크기3 μm

표면적0.75 m²/g

탄소 함량0.03%

pH 안정성1.5-8.5

출하 용매아세토니트릴/물 (60:40 v/v)

최대 압력15000/1034 psi/bar

최대 온도35 ℃ (Native RP-1), 35 ℃ (Native RP-5)

컬럼 검사 및 초기 점검

Biozen 컬럼은 개별적으로 제조 및 테스트되며, 품질 보증서(COA)를 통해 테스트 조건과 작동 매개변수를 확인할 수 있습니다. 컬럼 수령 시 아래의 절차를 따라 초기 검사를 진행하세요.

✔ 컬럼 검사 절차

주문 내용 확인

수령한 컬럼이 주문한 컬럼(크기, 입자 크기, 판매처)와 일치하는지 확인하세요.

물리적 손상 검증

배송 중 발생할 수 있는 물리적 손상이 없는지 신중하게 점검하세요.

품질 보증서(COA) 확인

각 컬럼에는 테스트 조건, 작동 매개변수 및 컬럼 세부 정보가 포함된 품질 보증서가 제공됩니다.

성능 테스트 및 기록

컬럼 성능을 즉시 테스트하고 결과를 관련 시스템에 기록하세요.

검수 체크리스트

✓컬럼 번호 및 모델 확인
✓컬럼의 물리적 상태(손상, 변형 없음)
✓밀봉 상태 및 손상 없음
✓품질 보증서(COA) 확인
✓출하 용매 및 저장 조건 확인
✓컬럼 성능 테스트 실행

팁

컬럼 성능 테스트를 통해 컬럼의 효율성, 피크 모양 및 분리능을 정기적으로 평가하여 잠재적인 문제를 조기에 감지할 수 있습니다.

시스템 준비 및 점검

✔ 시스템 준비 확인

쎌, 라이너, 인젝터 점검

컬럼 성능을 보장하기 위해 쎌, 라이너, 인젝터가 깨끗한지 확인합니다.

프라이밍된 라인 점검

기포가 없는지 확인하여 컬럼 설치 전 안정적인 흐름을 보장합니다.

안정화된 베이스라인 설정

이동상이 잘 흐르고 시스템이 안정화되었는지 확인합니다.

안정화된 시스템 압력 설정

컬럼 설치 전 시스템 압력이 지정된 최대 압력을 초과하지 않도록 합니다.

LC 시스템 주요 구성 요소

i인젝터

✓샘플 주입 전에 안정화 필요
✓클린룸 환경 유지

L라인

✓프라이밍 후 기포 제거
✓적절한 프리미드 시간 확보

D검출기

✓베이스라인 안정화 확인
✓감도 적절한 설정

P압력 시스템

✓최대 압력 한도 내에서 작동
✓압력 안정화 대기

이동상 및 용매 준비

일반 용매 준비

HPLC 등급 이상 용매 사용
컬럼 성능을 극대화하기 위해 HPLC 등급 이상의 용매만 사용합니다.
용매 혼화성 확인
모든 용매가 서로 잘 혼화되는지 확인합니다.
이동상 혼합 및 탈기
이동상이 잘 혼합되고, 탈기되어 있으며, 가능하면 신선하게 준비되었는지 확인합니다.
수성 버퍼 여과
0.2μm 필터로 여과하여 미생물 성장과 입자 오염을 방지합니다.

SEC 이동상 특별 고려사항

SEC 이동상의 경우, 미생물 성장에 취약하므로 기존 이동상 병을 다시 채우지 말고 신선하게 준비된 이동상으로 새 병을 사용하세요.

용매 주입 필터 사용 피하기
SEC 이동상의 경우, 미생물 성장의 원인이 될 수 있는 용매 주입 필터 사용을 피합니다.
니들 세척 및 프라임 용매
니들 세척 및 프라임 용매 버퍼/바이알이 적절한 용매로 충분한 양이 채워져 있는지 확인합니다.
보관 조건 준수
SEC 이동상 병은 항상 적절한 온도 및 조건에서 보관되어야 하며, 오염을 방지해야 합니다.

중요: 적절한 이동상 준비는 컬럼 성능과 수명에 직접적인 영향을 미칩니다.

컬럼 설치 절차

✔ 컬럼 설치 단계

컬럼 입구 끝을 인젝터 출구에 연결

안정적인 연결을 확인하고, 손상이 없고 기포가 없는지 점검합니다.

초기 유속을 0.1 mL/min으로 설정

점진적 유속 증가를 위해 낮은 유속에서 시작합니다.

유속을 0.2 mL/min으로 점진적으로 증가시킵니다

컬럼 내부 압력을 천천히 증가시켜 고장과 손상을 방지합니다.

컬럼 출구가 작은 비커로 5분 동안 흐르도록 합니다

출구에서 흐름 상태를 관찰하여 불균형이나 기포가 없는지 확인합니다.

컬럼 출구에 일정한 흐름이 있는지 확인한 다음 양쪽 끝을 닦습니다

안정적인 흐름과 깨끗한 연결을 유지합니다.

흐름을 일시 중지합니다

컬럼 설치를 위한 준비 단계입니다.

컬럼 출구 라인을 검출기에 설치합니다

검출기와 컬럼 연결을 올바르게 설정합니다.

유속을 메서드 유속으로 증가시키고 다음 단계로 이동

역압과 베이스라인이 안정화되었는지 확인합니다.

인젝터

검출기

설치 팁

컬럼을 설치하기 전에 시스템이 안정화되어 있는지 확인합니다
느린 유속에서 시작하여 점진적으로 증가시키는 것이 중요합니다

컬럼 컨디셔닝 및 평형화

일반 컬럼 컨디셔닝

시작 이동상 조건으로 10-20 컬럼 부피만큼 컬럼을 컨디셔닝합니다.
안정화된 역압과 검출기 신호가 관찰되면 컬럼이 평형화된 것으로 간주합니다.

HILIC 컬럼 추가 컨디셔닝

HILIC 컬럼은 최소 20-30 컬럼 부피만큼 컨디셔닝해야 합니다.

버퍼 침전 방지를 위한 플러싱

이동상 버퍼의 침전을 방지하기 위해, 컬럼을 먼저 비버퍼된 시작 조건으로 5 컬럼 부피만큼 플러싱하는 것이 좋습니다.

블랭크 주입 확인

분석 전에 최소 한 번의 블랭크 주입을 수행하여 시스템과 이동상에 오염이 없는지 확인합니다.

컨디셔닝 및 평형화 과정

시작 상태

컨디셔닝

평형화 완료

팁

컬럼 평형화는 분석 결과의 일관성과 신뢰성에 중요합니다.
안정화된 역압과 검출기 신호를 기준으로 평형화를 판단합니다.

권장 및 최대 유속

컬럼 모드	내경	유속 범위
Biozen RP	모든 내경	0.3 - 0.8 mL/min (허용 압력 범위 내에서 조절)
Biozen Native RP	모든 내경	0.1 - 1.0 mL/min (허용 압력 범위 내에서 조절)
Biozen HILIC	모든 내경	0.5 - 2.0 mL/min (허용 압력 범위 내에서 조절)
Biozen WCX	2.1 mm	0.1 - 0.3 mL/min
	4.6 mm	0.8 - 1.2 mL/min
Biozen SEC/GFC	2.1 mm	50 - 100 μL/min
	4.6 mm	0.2 - 0.4 mL/min
	7.8 mm	0.8 - 1.2 mL/min

유속 영향 요인

✓컬럼 내경: 내경이 작을수록 적절한 유속도 낮아집니다
✓입자 크기: 입자 크기가 작을수록 압력이 매우 높아지므로, 시스템의 압력 한계 내에서 최대 유속이 결정됩니다.
✓시스템 압력 허용 오차: 압력 한도를 초과하지 않도록 주의해야 합니다

주의사항

⚠️이러한 범위는 근사치이며, 시스템 역압이 가이드에 명시된 최대 압력을 초과하지 않도록 해야 합니다
⚠️유속은 컬럼 성능과 분석 결과에 직접적인 영향을 미칩니다
⚠️컬럼 명세서에 명시된 최대 압력을 초과하지 않도록 주의해야 합니다

컬럼 성능 테스트

성능 참조 표준을 사용하여 시간 경과에 따른 컬럼 성능을 확인하고 추세를 파악할 수 있습니다.

역상(RP) 컬럼

ALO-3045

모델Biozen Oligo

회석제아세토니트릴/물 (75:25)

주입량1 μL

이동상아세토니트릴/물 (65:35)

유속0.75 mL/min

UV254 nm

HILIC & 기타 RP 컬럼

ALO-8317

모델Biozen Glycan

회석제아세토니트릴/물 (85:15)

주입량1 μL

이동상아세토니트릴/물 + 암모늄 포르메이트

유속0.5 mL/min

UV254 nm

펩타이드 컬럼

ALO-3045

모델Biozen Peptide PS-C18

회석제아세토니트릴/물 (75:25)

주입량1 μL

이동상아세토니트릴/물 (65:35)

유속0.75 mL/min

UV254 nm

SEC

SEC 컬럼

ALO-9253

모델Biozen SEC-2

회석제100 mM 나트륨 포스페이트, pH 6.8

주입량0.7 μL

이동상100 mM 나트륨 포스페이트, pH 6.8

유속0.35 mL/min

UV280 nm

dSEC

dSEC 컬럼

dSEC-1 Mix

모델Biozen dSEC-1/dSEC-2

회석제0.05 mg/mL 우라실, 0.1 mg/mL 비타민 B12

주입량0.1 μL (dSEC-1), 0.7 μL (dSEC-2)

이동상0.01 M 포스페이트 버퍼, 0.0027 M KCl, 0.137 M NaCl

pH7.4 with 10% 아세토니트릴

ETC

기타 컬럼

Equine Cytochrome C**

모델Biozen WCX

회석제20 mM 나트륨 포스페이트, 150 mM NaCl

주입량5 μL

이동상20 mM 나트륨 포스페이트, 150 mM NaCl

유속1.3 mL/min

UV280 nm

팁: 동일한 테스트 조건을 사용하여 컬럼의 초기 성능을 확인하고, 시간이 지남에 따라 경향의 변화를 모니터링할 수 있습니다. 컬럼의 효율성, 피크 모양 및 분리능은 정기적으로 평가하여 잠재적인 문제를 조기에 감지하세요.

역상 컬럼 세척 - 일반 절차

Intact 분석용 컬럼

일반 세척 절차

✓50:50 아세토니트릴/물로 최소 20 컬럼 부피만큼 또는 정상 역압이 관찰될 때까지 플러싱
✓세척 절차 전후에 블랭크 주입을 수행하여 시스템과 이동상이 크로마토그래피 아티팩트에 기여하지 않는지 확인

대체 세척 절차

✓크로마토그래피 실행 중 혹은 시점의 조건으로 시작하여 유기 용매의 양을 단계적으로 증가
✓유기 용매 농도가 높아질 때 침전을 피하기 위해 비버퍼된 용매를 사용하는 것이 좋습니다
✓소수성 오염이 크면 IPA를 사용할 수 있습니다
✓IPA를 사용하는 용매 점도가 높아 역 압상승을 방지하기 위해 PA 비율이 높은 용매를 사용할 때는 반드시 유속을 절반 이하로 낮춰야 합니다.

peptide 분석용 컬럼

일반 세척 절차

✓50:50 아세토니트릴/물로 최소 20 컬럼 부피만큼 또는 정상 역압이 관찰될 때까지 플러싱
✓세척 절차 전후에 블랭크 주입을 수행하여 시스템과 이동상이 크로마토그래피 아티팩트에 기여하지 않는지 확인

대체 세척 절차

✓펩타이드 분석에서는 일반적으로 소수성 오염물질이 문제까지 되지 않지만, 의심되는 경우 IPA를 사용할 수 있습니다
✓IPA를 사용하는 용매 점도가 높아 역 압상승을 방지하기 위해 PA 비율이 높은 용매를 사용할 때는 반드시 유속을 절반 이하로 낮춰야 합니다.

중요: 강한 용매로 컬럼 세척(Wash)을 마친 후에는, 다음 분석을 시작하기 전에 반드시 초기 이동상 조건으로 10~20 컬럼 부피(Column Volume) 이상 충분히 흘려주어 컬럼을 재평형화해야 합니다.

역상 컬럼 세척 - 대체 절차

추가 세척이 필요한 경우, 다음의 대체 세척 절차를 활용하여 소수성 오염 물질을 제거할 수 있습니다.

IPA 사용 세척

점점 더 소수성인 오염 물질의 경우 IPA를 사용할 수 있습니다.
IPA가 포함된 용매를 사용할 때는 반드시 유속을 평소의 절반(50%) 이하로 낮추어 압력 상승을 방지해야 합니다.
세척 후에는 정상 역압이 관찰될 때까지 50:50 아세토니트릴/물로 최소 20 컬럼 부피만큼 플러싱합니다.

팁: IPA를 사용할 때는 유속을 낮추고, 필요하다면 온도를 조절하여 세척 성능을 최적화하세요.

THF 사용 세척

고도로 소수성인 오염 물질이 의심되는 경우 THF를 사용할 수 있습니다.
THF는 HPLC 시스템에 흔히 사용되는 PEEK (폴리에테르에테르케톤) 재질의 튜빙이나 씰(seal)을 팽윤(swelling)시키거나 손상시킬 수 있습니다.
THF를 사용하기 전에, 사용자의 HPLC/UHPLC 시스템(특히 펌프 씰, 인젝터 씰, 튜빙)이 THF에 대한 내성을 가지고 있는지(예: 스테인리스 스틸 시스템) 반드시 확인해야 합니다.

주의: THF 세척 후에는 **반드시 비버퍼링된 중간 용매(예: 100% 아세토니트릴 또는 IPA)**로 충분히(최소 10-20 컬럼 부피) 플러싱하여 THF를 완전히 제거한 후, 다음 단계(예: 50:50 ACN/Water)로 넘어가야 합니다.

이온쌍 시약 후 재평형화

이온쌍 시약(예: 알킬아민, TFA, 알킬설포네이트)은 이동상에 단순히 녹아있는 것이 아닙니다. 이 시약의 소수성 부분(꼬리)이 컬럼의 비극성 고정상(예: C18) 표면에 **흡착(adsorption)**되어 동적인 이온 교환 표면을 형성합니다.
30~40 컬럼 부피(CV)는 일반적인 역상 컬럼의 평형 시간(10~20 CV)보다 2~3배 긴 시간이며, 이는 안정적인 머무름 시간을 얻기 위한 최소한의 권장 사항입니다.
낮은 이온쌍 농도(<2 mM)을 사용할 때는 더 많은 컬럼 부피가 필요할 수 있습니다.

정보: 이온쌍 분석에서의 블랭크 주입은 컬럼이 완전히 평형화되었는지 판단하는 가장 확실한 지표입니다. 안정적인 블랭크 크로마토그램을 확인하는 것은 필수입니다.

보완 팁: 세척 절차 전후에 블랭크 주입을 수행하여 시스템과 이동상이 크로마토그래피 아티팩트에 기여하지 않는지 확인하세요.

HILIC 및 Oligo 컬럼 세척

HILIC 컬럼 세척

일반 세척 절차

컬럼을 **50:50 아세토니트릴/물(버퍼 제외)**로 최소 20 컬럼 부피만큼 플러싱하여, 염(salt)과 중간 극성 오염 물질을 제거합니다.
역압이 불안정하거나 강한 극성 오염이 의심되는 경우, 물 비율을 높여 5:95 아세토니트릴/물로 플러싱합니다.
지질, 단백질 등 비극성 오염이 의심되는 경우, 100% 아세토니트릴 또는 IPA로 20 컬럼 부피만큼 플러싱합니다.

주의사항

HILIC 컬럼은 극성 및 비극성 오염 물질 모두에 취약하므로, 세척 전후 블랭크 주입으로 오염 상태를 확인합니다.
세척 후 분석 이동상(높은 유기용매)으로 복귀 시, 최소 20-30 컬럼 부피의 매우 긴 재평형화가 필수적입니다.

Oligo 컬럼 세척

일반 세척 절차

목적: 컬럼에 흡착된 소수성 오염물질과 잔류하는 이온쌍 시약(예: HFIP, TEA)을 완전히 제거합니다.
1단계 (전환): 말씀하신 대로, 버퍼/이온쌍 시약의 침전을 방지하기 위해, 분석 조건에서 비버퍼링된 100% 아세토니트릴(ACN) 또는 100% 메탄올(MeOH)로 단계적으로(stepwise) 용매 조성을 변경합니다.
2단계 (세척): 100% ACN 또는 MeOH로 최소 20 컬럼 부피 이상 플러싱합니다.

특수 세척 용매

IPA
00% ACN으로 제거되지 않는 강한 소수성 오염물질 제거에 효과적

THF
지질이나 폴리머 등 고도로 소수성인 오염물질 제거에 사용

이온쌍 시약
30-40 컬럼 부피(CV) 이상의 긴 평형화는 재현성 있는 머무름 시간을 얻기 위해 필수적

SEC/GFC 컬럼 세척

일반 세척 절차

✓0.1M NaH2PO4 버퍼, pH 3.0으로 컬럼을 10 컬럼 부피만큼 플러싱합니다.
✓이어서 100% HPLC 등급 물로 최소 10 컬럼 부피만큼 플러싱합니다.
✓dSEC-1, dSEC-2 및 dSEC-7 컬럼을 제외하고는 역세척을 시도할 수 있습니다.
✓dSEC-1, dSEC-2 및 dSEC-7 컬럼은 역세척을 금지합니다.

역세척 방법

유속을 정상 유속 조건의 절반으로 줄입니다. 이 절차는 컬럼 입구 프릿(frit)에 쌓인 미세 입자나 응집체를 제거할 때만 사용합니다.
소수성 오염 물질이 의심되는 경우, 낮은 유속에서 100% 물에서 60% 아세토니트릴로 30분 동안 그라디언트를 올린 다음 30분 동안 100% 물로 내리면서 플러싱합니다. (역세척이 아닌, 정방향 플러싱을 권장합니다.)
컬럼 입구 오염을 방지하기 위해 가드 컬럼 사용을 권장합니다.

강하게 흡착된 단백질 제거를 위한 특수 세척

✓0.5% SDS, 6M 구아니딘 티오시아네이트 또는 10% DMSO로 10-20 컬럼 부피만큼 낮은 유속으로 세척합니다.
✓즉시 낮은 유속에서 물로 오버나잇 플러싱합니다.

팁 및 주의

SEC 컬럼은 미생물 성장에 취약하므로, 기존 이동상 병을 다시 채우지 말고 신선하게 준비된 이동상으로 새 병을 사용합니다.
또한, 용매 주입 필터가 미생물막(biofilm)의 서식지가 될 수 있으므로, 필터 역시 정기적으로 세척(예: 초음파 세척)하거나 교체하여 시스템 오염을 방지해야 합니다.

약한 양이온 교환(WCX) 컬럼 세척

일반 세척 절차

✓고이온 강도 용액: 1 M NaCl이 포함된 버퍼로 컬럼을 10-20 컬럼 부피만큼 세척합니다.
✓유속 조절: 역압을 모니터링하고 필요한 경우유속을 낮춥니다.

대체 세척 절차

강하게 흡착된 단백질 제거
0.1 M HCl로 5-10 컬럼 부피만큼 컬럼을 세척합니다. 그 후 20 mM MES, pH 6.5 또는 시작 이동상 조건으로 평형화합니다.
추가 세척 필요 시
20 mM NaOH로 5-10 컬럼 부피만큼 컬럼을 세척합니다. 20 mM MES, pH 6.5 또는 시작 이동상 조건으로 평형화합니다.
소수성 화합물 제거
50% 아세토니트릴/물로 5-10 컬럼 부피만큼 컬럼을 세척합니다. 20 mM MES, pH 6.5 또는 시작 이동상 조건으로 평형화합니다.

금지된 용매 및 조건

양성자성 용매 (메탄올 등 알코올)
양이온성 세제
극단적인 pH 조건
고온 조건

역세척 시 주의사항

역압 증가가 여전히 관찰되거나 프릿 막힘이 의심되는 경우, 아래에 제시된 감소된 유속으로 컬럼을 역세척할 수 있습니다.

0.1 mL/min (2.1 mm 직경 컬럼)
0.3 mL/min (3.0 mm 직경 컬럼)
0.5 mL/min (4.6 mm 직경 컬럼)

컬럼 보관 원칙

컬럼 보관 전에 컬럼이 깨끗한지 확인하는 것은 매우 중요합니다. 이는 컬럼의 고정상 손상을 방지하고, 미생물 성장을 억제하며, 컬럼의 성능을 장기간 유지하는 데 필수적입니다.

버퍼 제거

컬럼 보관 전에 모든 버퍼를 완전히 제거해야 합니다. 남아 있는 버퍼는 고정상과의 반응(예: 높은 pH 버퍼가 실리카를 용해)도 장기적으로 문제가 될 수 있지만, 더 즉각적이고 치명적인 문제는 **염의 석출(Salt Precipitation)**입니다.

염 제거

NaCl 등과 같은 염류는 컬럼 내 침전을 유발하여 고정상을 손상시키거나 시스템 압력을 높일 수 있습니다. 또한, 염이 포함된 버퍼는 장기간 보관 시 미생물 성장의 원인이 될 수 있습니다.

샘플 제거

분석에서 사용된 모든 샘플은 컬럼에서 완전히 제거되어야 합니다. 샘플은 고정상에 침착되어 손상이나 오염을 초래할 수 있습니다.

이온쌍 시약 제거

이온쌍 시약 제거 알킬아민과 같은 이온쌍 시약은 고정상에 강하게 흡착되어 컬럼 내에 잔류하기 쉽습니다. 이렇게 잔류한 시약은 컬럼의 성능 저하(예: 피크 모양 변형, 재현성 하락)를 유발할 수 있으므로, 보관 전 반드시 완전히 제거해야 합니다.

미생물 억제

SEC 컬럼의 경우, 미생물 성장에 취약할 수 있으므로 보관 조건을 적절히 선택하여 미생물 성장을 억제해야 합니다.

경고: 컬럼 보관 전에 반드시 깨끗한지 확인하십시오. 그렇지 않으면 컬럼의 수명이 단축되고, 성능이 저하될 수 있습니다.

역상 컬럼 보관 조건

Biozen 역상 컬럼은 적절한 보관 조건 하에 보관할 경우 긴 수명을 유지할 수 있습니다. 컬럼을 보관하기 전에는 내부에 남아있는 버퍼, 염, 샘플 및 이온쌍 시약 등을 반드시 제거하여 깨끗하게 세척해야 합니다.